德國picotweezers品牌，高分辨率三維單細胞單分子力學捕獲分析光鑷系統(tǒng)(3D Force Sensitive Optical Tweezers)

PicoTweezers是一種結合了光鑷技術及微視圖像計算集合的分子生物力學分析系統(tǒng)。PicoTweezers作為一個獨立的系統(tǒng)，可以與蔡司Axiovert、AxioA1或D1顯微鏡聯(lián)合使用。PicoTweezers配備了功率為1W或5W的紅外光纖激光器，可達激光陷阱捕獲力范圍是400pN——2nN。PicoTweezers的3D-壓電平臺可以實現(xiàn)x軸和y軸為200μn;m的分辨率，在z軸方向可以實現(xiàn)20μn;m的分辨率。獨特的視頻分析系統(tǒng)（Video-analysis）可以達到至少2.5納米的橫向和軸向分辨率，其圖像拍攝速率為200幀/秒，X、Y、Z互相成像速度為400赫茲，可對生物大分子進行0.1PN作用力分辨率的實時分析。 

圖1 PicoTweezers裝配示意圖
系統(tǒng)工作原理：
分子之間的作用力是在三維方向上分布的，所以為了計算大分子之間產(chǎn)生的各種作用力，需要在X、Y、Z三個維度上進行作用力的**檢測，并且要求在這三個維度的測量空間比較大，以實現(xiàn)實驗的自由度和多目的性。 
PicoTweezers系統(tǒng)使用視頻分析系統(tǒng)（右下圖）作為粒子追蹤、檢測和力測量的系統(tǒng)，該系統(tǒng)雖然相對復雜，但模塊化的配置和穩(wěn)定的組裝賦予了該系統(tǒng)易于使用的特征。 
在測量的過程中，被光阱捕獲的顆粒會在三個方向上對光進行阻擋，導致光線偏轉，PicoTweezers的視頻分析系統(tǒng)通過獲取偏轉的圖像來分析作用力的變化，進而可以分析分子之間作用力的變化。由于該系統(tǒng)非常穩(wěn)定，且不需要校準、沒有試驗和空間的限制，所以該系統(tǒng)應用領域非常廣泛，是生物學、分子生物學、材料學研究者在大分子生物力學研究中的***實驗儀器之一。 
系統(tǒng)擁有自動、簡單和可靠的力校準系統(tǒng)
該系統(tǒng)在三維空間中的力校準是通過斯托克斯阻力法移動3D-壓電平臺周邊的介質來進行的。在具體的應用中，作用力的檢測是通過基于視頻的Allan方差分析和校準途徑來實現(xiàn)的，其過程主要是通過對微小粒子的波動進行圖像記錄和分析，在此過程中，不需要施加任何摩擦力。在實驗過程中，斯托克斯方法和Allan方差都不需要對光阱剛度k進行判定，即使需要，視頻分析軟件可以自動進行計算。 
系統(tǒng)的計算原理
系統(tǒng)擁有兩臺高速數(shù)碼照相機。**臺照相機對光學阱捕獲的粒子的周圍區(qū)域進行成像，**臺高速CMOS照相機對被放大的粒子大圖像進行測量。相關的關鍵會實時分辨并鎖定每個幀圖像的邊緣部分，確定出圖像的灰階和合適的范圍，以此來確定或獲取粒子的直徑。 
當外在的作用力施加在粒子上面時導致粒子在Z-軸上發(fā)生位移時，粒子的直徑會發(fā)生變化，軟件會將這種變化通過Z-軸的作用力表現(xiàn)出來。而粒子受到水平方向上的作用力時，僅僅改變圖像的圓心的位置，但是其直徑并不會改變。這樣通過獲取圖像的位置的變化就可以分析粒子納米級別的水平方向受到的作用力，進而分析出粒子在X、Y軸上所受到的作用力。 

粒子在Z-軸上作用力會改變圖像的直徑，在X、Y軸上所受到的作用力會改變圖像的圓心位置
力測量的三種方式對比：
左邊：是傳統(tǒng)光鑷的監(jiān)測方法。激光通過捕獲粒子，然后收集前向散射光并投射到探測器感應粒子的偏轉。由于獲取圖像之前需要設置冷卻器以進行**地調(diào)節(jié)，這種設置獲取的圖像容易漂移和錯位，導致誤差； 
中間：從顆粒被捕獲的目標收集背散射光，入射激光設置分光器并投射到檢測器。這種方式測量的量程大，同樣可以建立基于視頻的檢測方法，但**度不夠。 
右邊：這是PicoTweezer的檢測方法，同樣也是通過設置并收集背散射光，然后通過分光器并投射到檢測器。但是PicoTweezer系統(tǒng)采用了高靈敏度的CMOS圖像傳感器進行處理，并添加一組聚焦透鏡進行圖像聚焦，從而可以實現(xiàn)對納米粒子圖像的更**測定。其建立的基于圖像的檢測方法允許粒子更高的多樣性，數(shù)據(jù)吞吐速度更快，分析效果更**。采用這種方法的優(yōu)勢之一是激光器和光阱之間的光學路徑無需對檢測器進行校準或調(diào)整，對于被監(jiān)測的對象粒子的直徑和移動可以被長期地監(jiān)測而不會發(fā)生漂移。 

圖 光鑷子測量分子力的三種方式對比 

圖PicoTweezers軟件工作界面
儀器亮點
1)定量在三維方向實現(xiàn)0.1 PN分辨率下的3D測量 
2)*大光阱捕獲力可在1 W光纖激光器下達到400 PN
3)通過光鑷實現(xiàn)對捕獲對象精度為納米級別的操控 
4)擁有緊湊、超穩(wěn)定模塊化系統(tǒng) 
5)可編程的LabVIEW?軟件界面
6)不需要檢測校準，軟件計算非常容易 
儀器應用范圍
1.)單分子與活細胞的操控和分析 
2)高分子彈性分析、微流控分析 
3)分子相互作用、納米孔分析 
應用案例
1)單分子的捕獲及分析
單個DNA鏈通過兩端的官能基團固定在兩個微珠之間。其中的一個微珠被玻璃微吸管固定，另外一個微珠被光鑷俘獲，通過移動壓電平臺增加珠之間的距離引起的受控DNA的機械張力。作為響應的分子的力 - 延伸曲線表現(xiàn)出DNA特定的機械性能，結果可以計算DNA的熵彈性，DNA的一個過渡延伸平臺區(qū)和熔融過渡區(qū)域。 


圖DNA分子的捕獲及分析圖譜
2)單個DNA鏈的易位過程分析
PicoTweezers可用于納米孔分子生物學的研究，他們迅速演變成單分子檢測領域一個非常新穎的技術。當單個DNA分子或DNA-蛋白復合物通過納米孔時，這個過程可以被PicoTweezers監(jiān)測并分析，相關數(shù)據(jù)可以確定DNA的易位動力學和DNA上結合的蛋白質的位置。 
納米孔測量的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在:(1)可在非常低的濃度和很小的樣品體積下測定目標分子;(2)可同時進行基因與生物標志物的篩選;(3)由于不需要進行放大及轉化,分析測量的速度將很快且費用低廉。 
當捕獲的的粒子上的DNA接近納米孔（至5微米的距離）時，帶負電荷的DNA通過DNA骨架的靜電力立即進入納米孔中，這種效果可以通過監(jiān)測的力信號得到。可以看到這種作用力在到達一定穩(wěn)定值后突然變化，顯示出DNA的易位過程。系統(tǒng)所測得的力取決于施加的電壓以及納米孔的直徑。當整個DNA鏈與納米孔另外一端的距離為10.5微米時，表明DNA鏈被拉出孔，所述力降回到零。 
目前PicoTweezers可結合各個實驗室已構建的納米尺度裝置對單分子進行分析。包括生物納米孔(通道) (由各類蛋白質分子鑲崁在磷脂膜上組成)、固態(tài)納米孔(通道)(包括各種硅基材料、SiNx、碳納米管、石墨烯、玻璃納米管等)及兩類相結合的雜化納米孔(通道)。 

 
圖 DNA的易位過程分析圖譜
3)單個DNA結合蛋白分析
當結合到DNA鏈上的單個過氧氧化還原酶通過納米孔過程中，會發(fā)生非對稱的力的信號。這種信號可以作為蛋白質在DNA上的結合位點的無標記的定位信息。相關的力學信息結合DNA和蛋白質的特征，可以進一步得出其蛋白質與DNA的結合作用力來源于蛋白質與DNA骨架電荷的作用力。當單個DNA結合蛋白通過納米孔時，DNA與結合蛋白之間的靜電引力減少，有助于分子通過微孔。 

圖單個DNA結合蛋白分析圖譜
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